熊猫体育官网培养的具体步骤如下：

1.熊猫体育官网复苏

将熊猫体育官网冻存从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。将融化的熊猫体育官网移入离心管中，加入37oC预热的DMEM完全培养基中(其中胎牛血清约为10%)，轻轻吹匀，离心，500g离心2min，弃上清液。

加入DMEM完全培养基清洗，弃上清液。加入DMEM完全培养基，轻轻吹打混匀，制成熊猫体育官网悬液，接种于培养皿/瓶中，在含5% CO2的熊猫体育官网培养箱中培养。

2.熊猫体育官网传代

当熊猫体育官网密度达到80%~90%(过早产量不足，过晚熊猫体育官网状态不佳，1:2至1:10以上的比率传代培养，一般1:3至1:5熊猫体育官网一代，即从熊猫体育官网接种到分离再培养的一段时间，非熊猫体育官网有丝分裂次数)时，去掉完全培养基，用1X PBS清洗2次。

加入胰蛋白酶(注意：消化液的量以盖住熊猫体育官网最好，最佳消化温度是37oC。显微镜下观察熊猫体育官网：倒置显微镜下观察消化熊猫体育官网，若胞质回缩，熊猫体育官网之间不再连接成片，表明此时熊猫体育官网消化适度)进行消化，放入熊猫体育官网培养箱中约2-3min。

加入适量DMEM完全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM完全培养基清洗，弃上清液。

加入DMEM完全培养基，轻轻吹打混匀，吸取10微升进行计数，然后按照所需熊猫体育官网量在含5% CO2的熊猫体育官网培养箱继续培养。

3.熊猫体育官网冻存

当熊猫体育官网密度达到80%~90%时，去掉完全培养基，用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶进行消化，放入熊猫体育官网培养箱中约2-3min。加入DMEM完全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM完全培养基清洗，弃上清液。加入lml冻存液(90%胎牛血清，10% DMSO。 一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整，冻存液中加入血清一方面可以为熊猫体育官网提供营养，另一方面可以在熊猫体育官网冻存过程中提供非渗透性保护物质，如蔗糖，白蛋白等从而更好地保护熊猫体育官网)，放入冻存管内(管内有异丙醇，以保证温度降低的速度)，立即放入4oC冰箱中冻存30min，然后放入-20oC冰箱中冻存30min，再置于-80℃冰箱内过夜。

第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

熊猫体育官网冻存和复苏的原则是：慢冻速融，这样更加有利于保持熊猫体育官网的活力。冻存熊猫体育官网不加任何保护剂，会导致熊猫体育官网内冰晶的产生，从而使熊猫体育官网产生内源性的机械损伤，引起熊猫体育官网内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使熊猫体育官网死亡。